重組蛋白操作步驟:
(一)獲得目的基因
1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
3、人工合成法:依照檢索到的目的基因序列,設(shè)計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸,再通過重疊延伸PCR法拼接出全長,這種方法無需模板,是目常用的獲取基因的手段之一。
(二)構(gòu)建重組表達載體
1、載體酶切:將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
(三)獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種
1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,根據(jù)重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。
2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。
商品屬性:
產(chǎn)品名稱:人甘露糖磷酸異構(gòu)酶(MPI)重組蛋白 物種:Homo sapiens (Human,人) 英文名稱:Recombinant Mannose Phosphate Isomerase (MPI)PMI1; Mannose-6-Phosphate Isomerase; Phosphohexomutase; Phosphomannose isomerase 型號:GOY-01D1656
物種:Homo sapiens (Human,人) 來源:原核表達 宿主:E.coli 內(nèi)毒素水平:<1.0EU/μg(LAL法測定) 亞細胞定位::n/a 預(yù)測分子量:50.2kDa 實際分子量:-(差異分析請參閱說明書) 片段與標簽:Ala2~Leu423 with 緩沖液成份:磷酸鹽緩沖液(pH7.4,含有 0.01% SKL, 1mM DTT, 5% Trehalose和Proclin300.) 性狀:凍干粉 純度:>95% 等電點:- 應(yīng)用:Positive Control; Immunogen; SDS-PAGE; WB. 規(guī)格:10μg50μg200μg1mg5mg |
重組蛋白有以下特點:
易于生長和控制;用于細菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細胞系統(tǒng)的材料昂貴;有各種各樣的菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)粒可供選擇。但是,在表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工,常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構(gòu)象。
表達載體在基因工程中具有十分重要的作用,原核表達載體通常為質(zhì)粒,典型的表達載體應(yīng)具有以下幾種元件:
(1)選擇標志的編碼序列;
(2)可控轉(zhuǎn)錄的啟動子;
(3)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子,核糖體結(jié)合位點);
(4)一個多限制酶切位點接頭;
(5)宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。

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關(guān)鍵詞:
人甘露糖磷酸異構(gòu)酶 MPI 重組蛋白
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